Neurobioloogias kasutatud uurimismeetodeid

Siin olen loetlenud varem viidatud uuringutes kirjeldatud uurimismeetodeid.

Ajuosade vaheliste ühenduste leidmisel kasutatakse tänapäeval tavaliselt värvainete süstimist mingisse närvisüsteemi osasse, misjärel lastakse neil mõnda aega levida. Nendeks aineteks on enamasti mädarõika peroksidaas (horseradish peroxidase), mis paistab kõige tavalisemana ja ultraviolettvalguses nähtavat FluoroGold'i. Need suudavad levida närviimpulsi liikumissuunast sõltumatult ühest raku otsast teise. Umbes sajandivanuse meetodina, mida ka vahel tänapäevastes artiklites leiab, süstitakse värvi asemel viirust vastavasse kohta. Levinumatena paistavad herpese ja marutõve viirused.

PET (positron emission tomography) puhul antakse patsiendile kiiresti lagunevaid radioaktiivsete isotoopidega molekule.

Nende lagunemisel kiirgub esialgu positron, mis on antimateeria versioon elektronist. Kui positron kohtub elektroniga toimub mõlema lagunemine ja tekib 2 vastassuunas liikuvat gammakiirguse footonit. Patsiendi ümber olev sensorite rõngas tuvastab kokkupuuted nende gamma footonitega. Samaaegselt ringile jõudnud signaalide järgi tuletatakse isotoobi lagunemise koht kehas.
PET skänner võimaldab vigastamata inimeste retseptoritega seondumist võrrelda rakku kogunemise järgi. Need ained püsivad mingi aja retseptori küljes ja ka kaootilisema kehas liikumise võimalusel kogunevad need peamiselt oma retseptorite juurde, kus need lagunemisel radioaktiivse kiirguse eritamisel võimaldavad keskmise allikkoha leida. Lisaks võimaldab see aju glükoosi tarbimist vaadelda andes radioaktiivset glükoosilaadset ainet, mis koguneb suuremas koguses rohkem glükoosi vajanud piirkondadesse.

CT (computed tomography) skännerid kasutavad paljusid eri nurkade alt tehtud röngtenpilte, et luua täpsem kujutus kehapiirkonnast või 3D pilt sellest. Üldiselt kasutatakse tänapäeval aju ehituse vaatamiseks MRI skännereid. CT suuremaks miinuseks on tavalise röngtenpildiga võrreldes kuni kümneid kordi suurema ioniseeriva kiirgusdoosi saamine, mis võib kaasa aidata kasvajate tekkele.

MRI skännerid kasutavad tugevat magnetvälja, et mõjutada keha aatomites olevaid prootoneid. Magentvälja lõpetamisel kiirgavad need aatomid elektromagneetilist kiirgust sensorite jaoks.

Diffusioon MRI puhul võrreldakse vee liikumist eri ajahetkedel ja närvisüsteemi uurimisel võimaldab see visualiseerida aksonites toimuvat vee liikumist. Nii saab kaardistada närvikiude elusates ja tuvastada vigastusi, mille juures sellised jooned katkeksid.

Funktsionaalse MRI (fMRI) puhul mõõdetakse muutusi verevoolus ja hapniku tarbimises. Hemoglobiin on hapnikuga seondunult erinevate magneetiliste omadustega, kui hapnikuta olekus. See suudab eristada suhteliselt suurema ja väiksema verevooluga piirkondi ning neid visualiseeritakse värviliste laikudena tavalise MRI pildi peal. Mitmetes uuringutes on mainitud kuupmillimeetrist täpsust visualiseerimisel.

Ka rangemalt reguleeritud psühhotroopsed ained nagu kokaiin ja heroiin on uuringuteks lubatud. Osad firmad müüvad neid oma lehekülgedel (1 näide) loaga ostjatele. Uuringus nimetatakse alati seda firmat ja võib-olla sellise kohustusliku äranimetamise pärast antakse neid aineid vahel tasuta uuringute jaoks. USAs võib neid saada ka valitsuse asutusest NIDA (National Institute on Drug Abuse).

Eksperimentides, kus süstitakse aineid mingisse kindlasse aju osasse või uuritakse neurotransmitterite taset, lisatakse operatsiooniga eelnevalt peenike kateeder vastavasse piirkonda ja lastakse loomadel paar päeva või nädalat taastuda operatsioonist enne katse algust. Pisikese ainekoguse süstimisel aktiveeritakse peamiselt süstekoha lähiümbrust, kuid täpsem leviku ulatus sõltub aine omadustest nagu molekuli suurus ja rasvlahustuvus. Süstimisel vähem levivad ained on näiteks kõik näljahormoonid ja paljud immuunsüsteemi poolt saadetud signaalhormoonid. Kergemini levivad väikesed molekulid nagu serotoniin, dopamiin ja noradrenaliin.

Spetsiifilisi neurotransmittererid sisaldavaid rakke saab tappa rakule mürgise saporiini kombineerimisel neurotransmitteriga. Neurotransmitterit tagasi võtvad transportvalgud võivad põhjustada ka saporiini raku sisse transportimist.

Neurotransmitterite vabanemist saab jälgida aeglaselt rakuvälise vedeliku kogumisega, mida nimetatakse ka mikrodialüüsiks. Sellisel juhul on kateedris jäetud ruumi asendusvedeliku sisse juhtimiseks. Inimeste puhul mäletan seni ainult ühte mikrodialüüsiga aju uuringut.

Loomade puhul lõpetatakse mikrodialüüsi, ajusse süstimise ja ajusisese elektroodiga uuringud loomade hukkamisega, et sisestatud kateedri või elektroodi täpse asukohta üle kontrollida.
Näriliste puhul on hukkamisel eetikanõuete järgi lubatud kaela murdmine või pea maha võtmine ning umbes pooltel juhtudel olen lugenud eelnevat narkoosi kasutamisest. Ahvide ja primaatide hukkamisel on eelnevalt alati paistnud tugeva narkoosi (tavaliselt ketamiin või barbiratuurid) kasutamist.

Elusaid ajuviile või tükke on eraldi vaadeldud näiteks spontaanse tegevuse, neurotransmitterite, liigse süsihappegaasi ja psühhotroopsete ainete kohaliku toime uurimiseks. Sellisel juhul eemaldatakse steriilses keskkonnas soovitud aju piirkond pärast aju eemaldust ja pandakse see "kunstlikusse selgroovedelikku", mis on kehatemperatuuri ja -soolasusega toitaineid sisaldav vedelik, millest 92% hapniku ja 8% süsihappegaasi segu läbi voolab. Kui need tükid on paari päeva pärast elus ja nakkuseta, siis alustatakse katset nagu elektrilise tegevuse mõõtmist või koostise (retseptorite hulk, c-FOS, neurotransmitterid jne.) analüüsi.

EEG puhul pandakse elektroodid peanaha pinnale, et nendeni jõudnud aju elektrilist tegevust mõõta. Miinusena on sellel meetodil raske täpset elektrilise tegevuse allikat piiritleda, kuid see sobib hästi epilepsia ja domineerivate ajulainete tuvastamiseks. Kui elektrood tuvastab väga suure laineamplituudiga tegevust näitab see, et paljud neuronid on korraga impulsi tekitanud. Sellised korraga tööle hakkamised esinevad pigem vähem teadvusel olles. Näiteks sügava une ajal domineerivad delta sagedusel (0,5-4 Hz) ajulained. Tänapäeval filtreerivad programmid uuritud vahemikus ajulained välja, kuid madalasageduslikku tegevust suudeti silma järgi kogutegevuse EEG'lt juba selle esimeste EEG kasutuselevõtjate poolt eristada.
Teadvusel oleku sümptomiks EEG'l kaldub olema gamma sagedusel tegevus, mis võib olla 30 kuni üle 100 Hz. Rahustid kalduvad aeglasemaid ajulaineid ilmsemaks tegema.

EEG'st täpsemat vaatlust saab teha ajusse paigutatud elektroodidega, mille elektrit juhtivad otsad on tihti nii väikesed, et eletkrilist tegevust saaks ühes või paaris rakus mõõta. Kuna üksikud närvimpulsid on sama tugevat aktiivsust tekitavad sõltumata sagedusest, siis saaks kaugemal olevate nõrgemate impulsside tegevuse programmi poolt välja filtreerida. Elektrilisele tegevusele avatud isolatsioonita kohti võib elektroodil mitu tükki reas olla. Samu elektroode võib kasutada ka elektri juhtimiseks ajusse ning võib valida millist elektroodil avatud piirkonda seda juhtida.

Inimestele on elektroode ajusse lisatud mõne ravimitele allumatu häire korral nagu liikumis- ja valuhäirete korral. Üksikjuhtudel ka kuklasagarale primitiivse nägemise taastamiseks. Kui operatsiooni käigus kahjustused välja jätta, siis ei paista nende kasutamisel senisel kujul kahjustusi ja stimulatsioonikohtade suremist üleaktiivsuse või immuunsüsteemi poolse rünnaku tõttu. Samas võib stimulatsioon sarnaselt stimuleerivate neurotransmitteritega eksitotoksilisuse tõttu rakke tappa ning sagedasel stimuleerimisel võib toime sarnaselt psühhotroopsete ainetega ajutiselt nõrgeneda või kaduda. Elektriline stimulatsioon ise võib sagedusest ja kohast sõltuvalt mõjuda piirkonda tavamõju osas aktiveerivalt, kuid tihti ka tegevust takistavalt.
Kasutatud voltidest sõltub, kui kaugel olevaid rakke stimuleeritakse. Tavaliselt kasutatakse alla 3 voldi ja ~2,5 voldine stimulatsioon aktiveerib umbes 2,5 mm raadiuses olevaid rakke, kui jätta välja stimuleeritud rakkude poolt mõjutatud rakud.

Hetkel tunduvad teadvuse tundmiseks lisaks ühenduste ja kahjustuste tagajärgede kirjeldamisele kasulikumad sellised artiklid, mis mõõdavad elektrilist tegevust kindla tegevuse ajal nagu puudutuste ajal sensoorses närvis või maitsetajul keelenärvis ja samuti need, kus kindla vahemikuga stimulatsioon suudab ettearvatavat reaktsiooni põhjustada. Selliseid ei leia kergesti, kuid nerve recording paistab ühe parema otsingusõnana neile.

Transkraniaalse magneetilise stimulatsiooni puhul paigutatakse kolju juurde juhe, millest juhitakse korraga läbi sellisel hulgal elektrivoolu, et voolu ümber tekkinud magnetväli suudab ajurakke aktiveerida või vähemalt nende impulsiteket mõjutada. Sellise mitteinvasiivse ajutegevuse mõjutamise miinuseks on aktiivsuse muutus laial aju piirkonnal ja see, et aktiveeruvad ettejäänud neuronid nahas ja aju katvates kihtides, mistõttu võib tunda staatilise elektri tunnet nahal või ka valu, kuid kohaliku tuimestuse kasutamisel võib seda kõrvalnähtu leevendada.

Immunohistokeemia on molekulaarbioloogias üheks tavalisemaks uurimismeetodiks, kus kasutatakse ultraviolettvalguses helendavaid antikehasid, mis kinnituvad kindlate molekulide külge.
Antikehasid võib luua peaaegu igasuguste molekulidega kinnitumiseks nagu allergiad demonstreerida võivad. Tõenäolisemalt tekivad need valkude ja peptiididega seondumiseks, kuid uuringute jaoks on loodud ka väiksemate molekulidega, nagu morfiiniga, seonduvaid antikehasid. Iga antikeha kiirgab erineva lainepikkusega valgust ja erinevate värvide välja filtreerimisel saab samades rakkudes olevate erinevate antikehade asukohti visualiseerida.
Näiteks saab neid kasutada apoptoosivalkude (toksilisuse hindamisel), neurotransmitterite, c-FOS, retseptorite jne. hulga visualiseerimiseks. Kasutatakse antikehasid, mis seonduvad spetsiifiliselt vaadeldud molekuliga ja tekitavad ultraviolettvalguses erinevat värvi. Markermolekulide tuvastamisel saab ka värvida erinevaid rakutüüpe, mis muidu oleks silmaga eristamatud olnud. Neurotoksilisust kontrollinud katsetes on näiteks märgistatud valke, mis esinevad spetsiifilisemalt enesetappu minevates rakkudes.

Pikaajalist aktiivsuse muutust saab leida c-FOS hulga immunohistokeemilise mõõtmisega rakkudes, mis tõuseb suurema aktiivsusega. Lühiajalisi muutusi sellega ei otsita, kuid see sobib tunde/päevi kestnud katsete puhul ning tavaliselt kasutatakse seda täiendusena pärast käitumise ja elektrilise aktiivsuse jälgimist. Selle kogust on uuritud näiteks pärast unepuudust, alatoitumist, janu või psühhotroopsete ainete saamist ning võrreldakse kontrollgrupiga, mis sai neutraalsemas keskkonnas elada.


Katseloomadeks sobivad mingil määral kõik selgrootud ja selgroogsed olendid. Neurotransmitterid ja nende retseptorid on suures osas ühised nii ussidel, putukatel kui imetajatel.
Selgroogsetel kaladest imetajateni on omaseks sarnase üldehitusega aju ehitus, mis sisaldab selgroonärvi, ajutüve, cerebellum'it, ajukoort koos kolju tagaosas asuvat nägemisalaga, taalamust, hüpotaalamust, ajuripatsit ja ajukoore esiosa juures asuvaid haistesibulaid. Mälus osaleb kõigil selgroogsetel umbes imetajate hippokampuse piirkonda jääv ajukoore alumine keskmine piirala. Ka basaalganglia paistab selgroogsetel roomajatest imetajateni olemas olevana.

Kahjustuste tekitamiseks katseloomadel kasutatakse operatsiooni ajal kirurgilist lõikamist, tugevat elektrivoolu või glutamaadi retseptorite agoniste (NMDA, glutamaat, naatriumglutamaat), mis panevad neuroneid üleaktiivsuse tõttu enesetappu tegema. Kuna glutamaadi retseptorid on kaltsiumit rakku laskvad kanalid ja iga närviimpulss põhjustab omakorda kaltsiumi sissevoolu aktiveeruvad teatud kaltsiumitaseme saavutamisel programmeeritud enesetappu põhjustavad valgud, mis muuhulgas liigse kaltsiumitaseme tõttu aktiveeruvad.

Geneetliste muudatuste läbiviimiseks kasutatakse tavaliselt viiruseid. Osad viirusnakkused jätavad jäädavama jälje genoomi, mis järglastele pärandub, ja suur osa inimese DNA'st paistab viiruste genoomide all olevana. Ühe allika järgi koosneb 8% inimese genoomist retroviiruste DNAst ja inimese enda geenid katavad üldise arusaama järgi ~1,5% DNAst. Viiruskapslites on tihti ruumi lisa DNA lisamiseks ja seda on geneetilisel moondamisel ära kasutatud. Osad viirused sisenevad suvalisse DNA piirkonda, kuid knock-out mutatsioonidel sobivad rohkem sellised viirused, mis sisenevad kindla järjestusega DNA piirkonda. Kuna osade katseloomade (hiired ja rotid) ja inimeste genoomist on lisaks teistele geenidele teada retseptorite geenid luuakse retseptori rikkumiseks viirused, mis siseneks ainult retseptori piirkonda, rikkudes sellega toimiva valgu sünteesi. Kui saada viljastatud munarakk, kus vastavat retseptorit või neurotransmitterit tootvat valgu geeni pole, saab sellest tihti elujõulise isendi, kelle ükski rakk neid valke toota ei suuda. Mõnikord on seejärel kasutatud knock-in mutatsiooni, kus kindlasse aju piirkonda süstitakse viirust, mis sisaldab näiteks retseptori geeni ja kuna kasutatud viirused ei paljune ajus agressiivselt edasi, siis saab panna spetsiifiliselt selle piirkonna rakke mingil määral vastavat geeni ekspresseerima. Retseptorite geene saab lisada ka teiste kudede rakkudele nagu näiteks söötmel elavatele inimeste neerurakkudele.